Single Cell Whole Genome Amplification Kit

Das neue Single Cell WGA Kit ermöglicht die millionenfache Amplifikation von Total-DNA einer Einzelzelle und erlaubt Ausbeuten von 2 - 5 μg in weniger als 3 Stunden! Das Protokoll ist dabei denkbar einfach: Sie resuspendieren eine Einzelzelle in 2,5 μl PBS und inkubieren diesen Ansatz zusammen mit dem DNA Extraction Cocktail des Kits in einem Thermocycler für ca. 20 min zur DNA Extraktion. Anschließend wird der Pre-Amplification Cocktail dazu gegeben und wiederum in einem Thermocycler für 12 Zyklen nach Vorschrift inkubiert. Zur nachfolgenden exponentiellen Amplifikationsphase mischen Sie nun einfach den Pre-Amp Mix mit dem Amplification Mix und setzen den Ansatz zurück in den Thermocycler. Nach nur 14 weiteren Zyklen erhalten Sie ca. 3 - 5 μg DNA bestehend aus einem Pool von 1000 bp Fragmenten.

Das Kit amplifiziert gleichermaßen sowohl AT-reiche als auch GC-reiche Regionen. Typischerweise sind ca. 70-90 % aller genomischen Loci mit beiden Allelen und einer hoher Reproduzierbarkeit im Amplifikat vertreten, während die restlichen Loci etwas geringer repräsentiert vorliegen. Das Single Cell WGA Kit ist kompatibel mit diversen Analyse-Methoden z.B. Copy Number Variation (CNV) Analyse mittels Oligonucleotide aCGH sowie qPCR, SNP Genotypisierungen, Mutation Detection und Sequenzierung.

Abbildung 1: Workflow		Ihr Vorteil: Zuverlässiges & reproduzierbares Kit-Format   Millionenfache Amplifizierung eines Einzelzellgenoms mit ca. 3-5 μg Ausbeute   Einfaches 3-Schritt Protokoll mit 95% Erfolgsrate bei Flow-sortierten Einzelzellen   Für Amplifikationen von DNA aus Einzelzellen oder Total-DNA aus bis zu 1000 Zellen einsetzbar

Abbildung 2: Die Effizienz der Amplifikation, d.h. der dsDNA Synthese durch das Single Cell WGA Kit kann durch den Einbau von SYBR Green I im qPCR Gerät analysiert werden. Typischerweise zeigen WGA Ansätze zwischen Zyklus 8-9 eine stark ansteigende Signalkurve die anschließend in ein Plateau übergeht. Die Negativkontrolle liefert mindestens 5 PCR-Zyklen später eine deutlich geringere Signalstärke. (gezeigte Daten von Rubicon Genomics Inc. auf einem Bio-Rad iCycler iQ™)

Abbildung 3: Typisches Gel von Amplifikaten Aufgetragen wurden 10 µl von 75 µl Reaktionen. Spur 1: keine DNA/Negativkontrolle, Spuren 2 und 3: unabhängige Reaktionen, je 15 pg humane genomische DNA; Marker M ist die 1 μg 2-Log DNA Ladder

Zusätzlich benötigte Materialen (nicht im Kit enthalten):

• PCR thermal cycler (Recommended: Real-time qPCR instrument) 
• PCR tubes or 96-well plates for cell extraction 
• PCR plate seals for pre-amp steps (Recommended: Microseal® 'F' Foil film, Bio-Rad Cat. #MSF-1001 or Axymat silicone sealing mats, Axygen Cat. #AM-96-PCR-RD) 
• PCR optically clear plate sealing film for amplification steps (Recommended: Microseal "B" film, Bio-Rad Cat. #MSB-1001) 
• Low Binding Barrier Filter pipette tips 

Note: Considerable (> 5 μl) evaporation may occur during step 6 of the Pre-Amplification Protocol if the incubation is being performed in a PCR tube or plate without a tight seal. Evaporation may reduce the robustness and reproducibility of the Single Cell WGA Kit. A mock step 6 incubation from the Pre-Amplification Protocol using 15 μl of water is recommended to confirm the suitability of the selected tube or plate/seal combination. 
PBS buffer for cell washes (Recommended: 20X PBS, Cell Signaling Technology Inc. Cat. #9808 or 10X PBS, USB Corporation Cat. #75889) 

• DNA purification system (Recommended: DNA Clean & Concentrator™-5 Kit, Zymo Research Cat. #D4014 or MultiScreen PCR₉₆ Plate, Millipore Cat. #MSNU03050 or QIAquick PCR Purification Kit, Qiagen #28104) 
• SYBR Green I dye (Recommended: Invitrogen Cat. #S7563) 

Note: Dye can be diluted to an intermediate concentration in DMSO for storage at -20°C. For the final working stock, this intermediate stock can be further diluted in 1X TE (pH 8.0) for storage at 4°C for up to 1 month.