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Phusion High Fidelity DNA Polymerase

Thermostabile (PCR-fähige) Polymerasen sind von Hause aus meist nicht besonders prozessiv. Das bedeutet, dass bei Bindung der Polymerase an der Template-DNA der zu synthetisierende DNA Strang nur um wenige Basen verlängert wird, bevor die Polymerase dissoziiert und erneut binden muss. Somit sind selbst für eine Verlängerung von nur kurzen DNA Sequenzen vielfache Bindungsereignisse notwendig. Der Prozess des kontinuierlichen „Dran-und-Weg“ ist daher der geschwindigkeitsbestimmende und limitierende Schritt einer PCR.

Ihre Vorteile:
  • Hohe Genauigkeit: 52-mal genauer als Taq
  • Hohe Geschwindigkeit: nur 15-30 Sekunden/kb
  • Lange Amplifikate mit hohen Ausbeuten auch bei schwierigen Templates
  • Phusion® Hot Start Flex Variante: Aptamer-Technologie für erhöhte Flexibilität, Spezifität und Ausbeuten ganz ohne Hitze-Inaktivierung

Die Phusion Polymerase Technologie

Die Phusion® HighFidelity DNA Polymerase ist eine künstlich hergestellte „Chimäre“ aus einer Pyrococcus-ähnlichen Polymerase und einer zusätzlich eingefügten dsDNA-Bindenen Proteindomäne. Dank dieser sog. ssO7d-Domäne ist die Prozessivität der Phusion Polymerase – d.h. die „Verweildauer“ pro Bindeereignis – im Vergleich zu anderen Enzymen dramatisch erhöht: es „saust“ am Template DNA Strang entlang und die neue DNA wird in einem Bruchteil der Zeit synthetisiert. Die Phusion Polymerase ist daher besonders schnell und für längere Amplikons und für hohe Genauigkeit gut geeignet!

Abb.: Phusion DNA Polymerase:
Die eingefügte Doppelstrang-bindende „Enhancer“-Domäne (orange) ermöglicht eine extreme Prozessivität, Genauigkeit und Zuverlässigkeit. Auch als Phusion® Hot Start Flex Variante erhältlich: eine Aptamer-Technologie ermöglicht erhöhte Flexibilität, Spezifität und Ausbeuten ganz ohne Hitze-Aktivierung.

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Abb.: Ein 3.8 kb Fragment wurde aus 50 ng genomischer Jurkat-DNA mit verschiedenen Polymerasen nach Angaben der Hersteller amplifiziert. Die Länge des Extensionsschritts wird in Minuten angegeben. Ladder L ist die 1 kb DNA Leiter #N3232.

Für noch bessere Ergebnisse empfehlen wir Q5 DNA Polymerase.

Klicken Sie hier für weitere Informationen.

Fokus Genauigkeit

Für alle Anwendungen, in denen eine korrekte DNA Sequenz notwendig ist (z.B. DNA-Klonierung, Proteinexpression, Reportergenassays) benötigen Sie zur DNA Amplifikation mittels PCR eine Polymerase mit 3’->5’ Exonukleaseaktivität (genannt „proof-reading“). Diese Exonuklease „kontrolliert“ während der DNA Synthese jeden Einbau eines neuen dNTPs und „schneidet“ am 3’ Ende eine falsch eingebaute Base sofort wieder heraus. So wird eine nahezu fehlerfreie Synthese ermöglicht. Bekannte Polymerasen mit proof-reading Aktivität sind zum Beispiel NEBs Vent® und DeepVent® Polymerase, Pyrocossus furiosus (Pfu) Polymerase und andere archaebakterielle DNA Polymerasen sowie Phusion® DNA Polymerase. Die Genauigkeit des proof-readings, d.h. die Aktivität der 3’->5’ Exonuklease ist von Polymerase zu Polymerase unterschiedlich und kann in sog. LacI Assays quantitativ gemessen und verglichen werden.

neb_phusion_fidelityAbb.: Die Fehlerrate der NEB Phusion® Polymerase ist dank der zusätzlich eingefügten DNA-bindenen Domäne mit 4,4×10-7 sehr gering. Phusion DNA Polymerase ist über 50x genauer als Taq und über 6x genauer als Pfu DNA Polymerase. Eine noch höhere Genauigkeit finden Sie bei der Q5 DNA Polymerase.

Fokus Geschwindigkeit

Thermostabile (PCR-fähige) Polymerasen sind meist von Haus aus nicht besonders prozessiv. Das bedeutet, dass bei Bindung der Polymerase an der Template-DNA der zu synthetisierende DNA Strang nur um wenige Basen verlängert wird, bevor die Polymasere dissoziiert und erneut binden muss. Somit sind selbst für eine Verlängerung von nur kurzen DNA Sequenzen vielfache Bindungsereignisse notwendig. Der Prozess des kontinuierlichen „Dran-und-Weg“ ist daher der geschwindigkeitsbestimmende und limitierende Schritt der gesamten Reaktion.

Aufgrund des „dissoziativen“ Charakters der Polymerasen ergeben sich auch die aus der Praxis bekannten Cycler / Extensionzeiten von ca. 1 min pro Kilobase bei Taq DNA Polymerase. Bei Pfu und anderen Enzymen mit proof-reading Aktivität sind sogar bis zu 2 min pro Kilobase für eine hinreichende Amplifikationsausbeute notwendig.

Phusion® DNA Polymerase hingegen benötigt lediglich 15-30 Sekunden pro Kilobase für exzellente Ausbeuten!

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Focus Schwierige Templates

DNA mit besonderen Sekundärstrukturen, GC-reichen oder Loop-Sequenzen ist häufig nur sehr schwer oder gar nicht amplifizierbar: die Polymerase kann tatsächlich in diesen „schwierigen“ Sequenzen nur sehr schwer oder gar nicht wieder binden. Eine Amplifikation dieses Abschnittes bleibt daher häufig aus. Die Phusion® Polymerase ist dank der verbesserten Prozessivität auch für schwierige und lange Amplikons bestens geeignet. Durch die Wahl des beiliegenden GC-Puffers  werden Sekundärstrukturen der Template-DNA gut aufgelöst und für die PCR zugänglich gemacht. Lange Amplikons z.B. bis 20 kb auf humaner gDNA werden mit der Phusion® Polymerase sehr gut amplifizierbar.

Beispiel: Ein 3,8 kb Fragment wurde aus Jurkat gDNA mit unterschiedlichen Polymerasen nach Herstellerempfehlungen amplifiziert. Die Extensionzeiten finden Sie über der jeweiligen Spur (in Minuten). Nur Phusion® DNA Polymerase amplifizierte dieses Amplikon mit hohen Ausbeuten.

Bestellinformationen

PRODUKT Art.Nr.: GRÖSSE PREIS
Phusion® High-Fidelity DNA Polymerase M0530S 100 units 94 € NEB Shop_icon
Phusion® High-Fidelity DNA Polymerase M0530L 500 units 416 € NEB Shop_icon
Phusion® High-Fidelity HF PCR Master Mix M0531S 100 rxn (à 50 µl volume) 158 € NEB Shop_icon
Phusion® High-Fidelity HF PCR Master Mix M0531L 500 rxn (à 50 µl volume) 627 € NEB Shop_icon
Phusion® High-Fidelity GC PCR Master Mix M0532S 100 rxn (à 50 µl volume) 158 € NEB Shop_icon
Phusion® High-Fidelity GC PCR Master Mix M0532L 500 rxn (à 50 µl volume) 627 € NEB Shop_icon
Phusion® High-Fidelity PCR Kit M0533S 100 rxns (à 50 µl volume) 162 € NEB Shop_icon
Phusion® High-Fidelity PCR Kit M0533L 500 units (à 50 µl volume) 648 € NEB Shop_icon

Phusion Hot Start Flex Polymerasen

PRODUKT Art.Nr.: GRÖSSE PREIS
Phusion® Hot Start Flex DNA Polymerase M0535S 100 units  108 € NEB Shop_icon
Phusion® Hot Start Flex DNA Polymerase M0535L 500 units 490 €  NEB Shop_icon
Phusion® Hot Start Flex 2X Master Mix M0536S 100 rxn (à 50 µl volume) 180 € NEB Shop_icon
Phusion® Hot Start Flex 2X Master Mix M0536L 500 rxn (à 50 µl volume)  715 € NEB Shop_icon

passend dazu:

PRODUKT Art.Nr.: GRÖSSE PREIS
Deoxynucleotide Solutions, Mix N0447S 8 µmol each 59 € NEB Shop_icon
Deoxynucleotide Solutions, Mix N0447L 40 µmol each 236 €  NEB Shop_icon

Stand: 02.01.2017

Legal notice
Licenses/Patents/Disclaimers:
Phusion® DNA Polymerase was developed by Finnzymes Oy, now a part of Thermo Fisher Scientific. This product is manufactured by New England Biolabs, Inc. under agreement with, and under the performance specifications of Thermo Fisher Scientific. Phusion® is a registered trademark and property of Thermo Fisher Scientific.
Notice to purchaser: Limited license.
The purchase price of this product includes a limited, non-transferable license under U.S. and foreign patents owned by BIO-RAD Laboratories, Inc., to use this product. No other license under these patents is conveyed expressly or by implication to the purchaser by the purchase of this product.
The purchase price of this product includes a limited, non-transferable license under a patent owned by New England Biolabs, Inc., to use this product. No other license under this patent is conveyed expressly or by implication to the purchaser by the purchase of this product.
Nucleic acid-based aptamers for use with thermophilic DNA polymerases are licensed exclusively by New England Biolabs, Inc. from SomaLogic, Inc. (See Patent Nos. 5,475,096; 5,670,637; 5,696,249; 5,874,557; and 5,693,502). New England Biolabs, Inc. gives the Buyer/User a non-exclusive license to use the aptamer-based Phusion Hot Start Flex DNA Polymerase for RESEARCH PURPOSES ONLY. Commercial use of the aptamer-based Phusion Hot Start Flex DNA Polymerase requires a license from New England Biolabs, Inc. Please contact  busdev@neb.com for more information.

Weiterführende Informationen finden Sie unter Technische Ressourcen oder auf neb.com