Rapid PCR Cleanup Banner

PCR Aufreinigung

Enzymatische PCR-Aufreinigung mit Exonuclease I und Shrimp Alkaline Phosphatase

Sie wollen Ihr PCR Produkt direkt sequenzieren? Dann reinigen Sie es doch am bequemsten enzymatisch: schnell und verlustfrei. Exonuclease I (Exo I, #M0293) degradiert restliche Primer und die Shrimp Alkaline Phosphatase (rSAP, #M0371) dephosphoryliert verbleibende dNTP.

Die Enzyme können dabei einfach nach der PCR zugegeben werden, sie sind in allen gängigen PCR-Puffern aktiv.

Nach Inaktivierung der Enzyme können Sie direkt mit der Sequenzierung beginnen.

DNA Cleanup Workflow rSAP Exoxo

Abb 1: Workflow-Diagramm. Klicken Sie zum Vergrößern.

Protokoll

1. Zugabe von 0,5 μl Exo I und 1 μl rSAP zu 5 μl PCR-Produkt.

2. Inkubation bei 37 ° C für 15 Minuten.

3. Inaktivieren bei 80 ° C für 15 Minuten.

4. PCR-Produkte sind bereit zur Sequenzierung.

DNA Cleanup Sequencing Results

Abb 2: Sequenzierung mit und ohne enzymatische Aufreinigung. Panel A und C zeigen unbehandelte Proben von 1,5 kb bzw. 150 bp PCR-Produkten. Panel B und D zeigen dieselben PCR-Produkte, die vor der Sequenzierung mit ExoI und rSAP behandelt wurden.

Gel Analysis of PCR Products

Abb 3: Agarosegelanalyse von PCR-Produkten (A: 1,5 kb; B: 150 bp), die entweder mittels Zentrifugen-Säule oder enzymatisch gereinigt wurden. Die Ergebnisse zeigen keinen Produktverlust durch die enzymatische Reinigung.

Ergebnis

Ein PCR-Amplikon von 1,5 kb Länge wurde unter Verwendung von OneTaq® 2X Master Mix mit Standard-Puffer # M0482 gemäß Protokollempfehlung hergestellt. Das PCR-Produkt wurde mit und ohne  Exo I und rSAP Behandlung Sanger-sequenziert (2) und im Gel analysiert (3). Die Behandlung führte zu einer signifikanten Verbesserung der Sequenzqualität ohne Verluste bei der Ausbeute.

Enzymatische Aufreinigung mit Exo I und rSAP ist eine bequeme Methode zur Aufarbeitung von PCR-Produkten für anschließende Sequenzierung oder Analysen. Mit minimaler Arbeitszeit erhalten Sie verlustfrei qualitativ hochwertige Sequenzergebnisse.

Produktabelle

PRODUKT Art.Nr.: GRÖSSE PREIS
Exonuclease I M0293S/L 3.000 / 15.000 u 69 € / 276 € NEB Shop_icon
Shrimp Alkaline Phosphatase (rSAP) M0371S/L 500 / 2.500 u 60 € / 240 € NEB Shop_icon
Weitere Produkte:
OneTaq 2X Master Mix with Standard Buffer M0482S/L 100 / 500 rxns 39 € / 156 € NEB Shop_icon
Quick-Load® Purple 1 kb DNA Ladder N0552S 125 gel lanes 57 € NEB Shop_icon
PCR Marker N3234S/L 100 / 500 gel lanes 60 € / 240 € NEB Shop_icon

Stand: 02.01.2017

Weiterführende Informationen finden Sie unter Technische Ressourcen oder auf neb.com