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Antikörper-freie Zellfärbung (SNAP-tag)

Antikörper-freie Zellfärbung mit der SNAP-tag Technologie

Die SNAP-tag Technologie für Antikörper-freies Live Cell Imaging und viele weitere Anwendungsgebiete ist nicht zuletzt durch den Nobelpreis für Chemie 2014 für Stefan Hell in den Fokus der Forscher gerückt.
Stefan Hell hat die SNAP-tag Technologie im Zusammenhang mit der STED-Mikroskopie eingesetzt und interessante Paper dazu verfasst.

Lernen auch Sie die überlegenen Vorteile der SNAP-tag Technologie für Ihre Forschung kennen und lieben.

Die SNAP-tag bzw. CLIP-tag Protein-Labeling Technologie von NEB bietet Ihnen eine einfache, schnelle und zuverlässige Methode zur antikörperfreien Markierung Ihres Zielproteins für unterschiedliche in vivo- und in vitro-Applikationen.

Das Prinzip ist so einfach wie clever:
Sie exprimieren Ihr Zielprotein als Fusion mit dem SNAP-tag. Dieser bindet dann kovalent und hochspezifisch ein markiertes Benzylguanin-Substrat Ihrer Wahl.

Starter Kits – Alles für den Einstieg

Der SNAP- oder CLIP-tag des Zielproteins bindet die gewünschte Markierung „X“ unter Abspaltung von Guanin bzw. Cytosin.

Workflow

SNAP-Tag Workflow

Klonieren Sie Ihr Zielprotein als SNAP-tag Fusion. Nach transienter oder stabiler Transfektion und und Expression des Fusionsproteins geben Sie das SNAP-tag Substrat Ihrer Wahl dazu (hier: Fluoreszenz-Konjugat), welches durch Diffusion in die Zelle gelangt. Nach Waschen des ungebundenen Substrats ist Ihr Zielprotein kovalent mit dem Fluorophor verknüpft und bereit zur weitere Experimente (hier Mikroskopie).

SNAP-tag Einstieg leicht gemacht: Nutzen Sie gerne unsere Videotutorials

Fluorescent Labeling of COS-7 Expressing SNAP-tag® Fusion Proteins for Live Cell Imaging

Ein Konstrukt – Viele Anwendungen

Die SNAP-tag Technologie bietet Ihnen neben einfachem „Live Cell Imaging“ eine Reihe an exklusiven Anwendungen, die mit anderen Methoden, wie z.B. Antikörper-Anwendungen oder GFP-Fusionen, nicht möglich sind!

Die SNAP-tag Technologie ist besonders geeignet für Fragestellungen zu Protein-(Trans-)-Lokation, Rezeptor-Internalisierungen oder Protein-Dynamik.

SNAP-tag Substrate für verschiedene Applikationen:
NEB bietet Ihnen eine Vielzahl an SNAP-tag Substraten „ready to- use“ für Ihre Versuche an. Hier finden Sie Fluorophor-Konjugate unterschiedlicher Wellenlängen ebenso wie Beads oder Biotin-konjugiertiert Substrate.

Applikationen:

  • Fluoreszenzmikroskopie (inkl. Super-Resolution)
  • Pulse/Chase Studien in lebenden Zellen
  • selektive Zelloberflächen-Markierung
  • Durchflusszytometrie
  • Proteinimmobilisation
  • Pull-Down Assays, Protein-Arrays
  • Aufreinigung
  • Direkte Proteindetektion in SDS-PAGE
  • Protein-Bindestudien
  • FRET/HTRF Assays
  • etc.

SNAP-tag:

Multiplex tagging Tools for the Study of Protein Dynamics and beyond

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Eine vollständige Liste aller SNAP-Produkte inklusive aller verfügbaren Fluorophore finden Sie in der Broschüre „Cellular Imaging and Analysis“

Broschüre downloaden (PDF)

Forschen Sie wie ein Nobelpreisträger

SNAP-tag Technologie in der STED-Mikroskopie und anderen Super-Resolution Systemen

Die SNAP-tag Technologie lässt sich neben der konfokalen Fluoreszenz-Mikroskopie auch hervorragend in modernen Super-Resolution Systemen nutzen.

Auch der Göttinger Nobelpreisträger Stefan Hell hat bereits mit SNAP-tag in STED publiziert:

Konfokal  bzw. STED- Mikroskopie an lebenden U2-OS Zellen: Zellen exprimieren das Mikrotubuli-bindende Cep41-SNAP-tag Fusionsprotein, nachgewiesen mit SNAP-Cell® 647SiR

Lukinavičius G et al. (2013) „A near-infrared fluorophore for live-cell super-resolution microscopy of cellular proteins.“ Nat. Chem. 5(2): 132-9.

Vergleich der SNAP-tag® / CLIP-tagTM Technologie mit GFP

Die SNAP-tag Technologie erscheint auf den ersten Blick der Verwendung von GFP-Fusionsproteinen (GFP = Green Fluorescent Protein) sehr ähnlich, in vielen Anwendungen hat diese Technologie aber entscheidende Vorteile.

Anwendung SNAP-tag/CLIP-tag GFP bzw. andere fluoreszente Proteine
Untersuchung dynamischer Vorgänge in der Zelle Die Markierung der Proteine erfolgt durch Zugabe des Substrat. Die Fluroeszenz/ Farbe ist genetisch codiert und wird dauernd exprimiert.
Auch benötigen photoaktivierbare fluoreszente Proteine energiereiches Laser-Licht, welches unter Umständen zelluläre Mechanismen beeinflussen kann (z.B. Aktivierung der Apoptose).Auch benötigen photoaktivierbare fluoreszente Proteine energiereiches Laser-Licht, welches unter Umständen zelluläre Mechanismen beeinflussen kann (z.B. Aktivierung der Apoptose).Auch benötigen photoaktivierbare fluoreszente Proteine energiereiches Laser-Licht, welches unter Umständen zelluläre Mechanismen beeinflussen kann (z.B. Aktivierung der Apoptose).
Pulse-Chase Experimente Die Markierung neu synthetisierter Proteine kann zwischenzeitlich durch Blockierungsreagenzien abgeschaltet werden. Es ist nicht möglich, die Fluoreszenz neu synthetisierter Proteine gezielt abzuschwächen.
Verwendung verschiedener Farbspektren zur Markierung Das gleiche Konstrukt kann durch Verwendung verschiedener Substrate mit zahlreichen Farbstoffen markiert werden. Um das gleiche Protein mit unterschiedlichen Farbstoffen zu markieren sind separate Klonierungen notwendig.
Exklusive Markierung von Proteinen an der Zelloberfläche Durch die Verwendung nicht-zellpermeabler Farbstoffe können exklusiv Proteine an der Zelloberfläche markiert werden. Keine Möglichkeit der spezifischen Markierung von Protein-Subpopulationen an der Zelloberfläche.
Untersuchung fixierter Zellen Markierung wird durch die Fixierung nicht beeinflusst. Fluoreszente Proteine sind häufig empfindlich gegenüber Fixativen.
Pull-Down Versuche SNAP-tag Fusionsproteine können durch Bindung an BG Beads aufgereinigt werden. Nur durch Verwendung eines Anti-GFP Antikörper möglich.


SNAP-Cell® Starter Kit (#E9100)

  • Plasmid: pSNAPf Vector
  • Fluorophore: SNAP-Cell® 505, SNAP-Cell® TMR-Star
  • Block: SNAP-Cell® Block
  • Das SNAP-Cell Starter Kit enthält alle Komponenten für den erfolgreichen Start in die Antikörper-freie Zellfärbung. Mit Plasmid, geeigneten Fluorphoren und Blocking Reagenz können Sie lebende Zellen anfärben, egal ob intrazellulär oder an der Oberfläche.
Zum Shop

Troubleshooting

Applikation Problem Möglicher Grund Lösung
Zellfärbung Keine Färbung Fusionsprotein wurde nicht exprimiert Transfektion überprüfen
Expression des Fusionsproteins mittels Western oder SDS-PAGE (Vista Green)
Schwache Färbung Ungenügende Substrat-Inkubation Substratkonzentration erhöhenInkubationszeit verlängern
Geringe Expression und/oder hoher Turnover des Zielproteins Samples unmittelbar nach der Färbung analysieren
Hoher Hintergrund Unspezifische Bindung desSubstrates Substratkonzentration verringernInkubationszeit verkürzenZugabe von FCS oder BSA während der Färbung
Signal verschwindetinnerhalb kurzer Zeit Fusionsprotein ist nicht stabil Zellen fixierenTag vom N-terminus zum C-terminus verlagern (und vice-versa)
Photobleaching Zugabe von Anti-Fade ReagentBelichtungszeit und/oder -Intensität verkürzen
in-vitroFärbung Präzipitation Unlösliche Fusion
  1. pH-Wert optimieren [pH5-10]
  2. Ionenstärke anpassen
  3. Salzkonzentration optimieren [50 bis 250 mM]
Hoher Hintergrund Farbstoff adsorbiert Fusionsprotein Zugabe von 0.05 – 0.1% Tween20
Schwache oderfehlende Färbung Substat wurde nicht im Überschusszugegeben
  1. Verdoppelung der Inkubationszeit auf 2 Stunden bei 25°C oder 24 Stunden bei 4°C
  2. Reduktion der Proteinmenge (Volumen) um 50%
  3. Expression des Fusionsproteins mittels Western oder SDS-PAGE (Vista Green)
Signal verschwindetinnerhalb kurzerZeit Fusionsprotein ist nicht stabil
  1. Inkubationszeit verkürzen
  2. Inkubationstemperatur verringern

Publikationen

Reviews

Lukinavičius, G. et al. (2015) „Fluorescent labeling of SNAP-tagged proteins in cells“ Methods Mol. Biol. 1266, 107-118.Corrêa Jr., I. R. (2015) „Considerations and protocols for the synthesis of custom protein labeling probes“ Methods Mol. Biol. 1266, 55-79.Corrêa Jr., I. R. (2014) „Live-cell reporters for fluorescence imaging“ Curr. Opin. Chem. Biol. 20, 36-45.

STEDGuzmán, C. et al. (2014) „The efficacy of Raf kinase recruitment to the GTPase H-ras depends on H-ras membrane conformer specific nanoclustering“ J. Biol. Chem. 289, 9519-9533.Stagge, F. et al. (2013) „Snap-, CLIP- and Halo-Tag Labelling of Budding Yeast Cells“ PLoS One 8(10): e78745.Lukinavičius, G. et al. (2013) „Selective Chemical Crosslinking Reveals a Cep57-Cep63-Cep152 Centrosomal Complex“ Curr. Biol. 23, 265-270.Lukinavičius, G. et al. (2013) „A near-infrared fluorophore for live-cell super-resolution microscopy of cellular proteins“ Nat. Chem. 5, 132-139.Pellett P. A. et al. (2011) „Two-color STED microscopy in living cells.“ Biomed. Opt. Expr. 2, 2364-2371.Testa I. et al. (2010) „Multicolor Fluorescence Nanoscopy in Fixed and Living Cells by Exciting Conventional Fluorophores with a Single Wavelength“ Biophys. J. 99, 2686-94.Hein B. et al. (2010) „Stimulated Emission Depletion Nanoscopy of Living Cells Using SNAP-Tag Fusion Proteins.“ Biophys. J. 98, 158–163.

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Protein-Protein and Protein-Ligand Interactions:

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Weiterführende Informationen finden Sie unter Technische Ressourcen oder auf neb.com