6 Tipps für Ihre DNA-Aufreinigungen

DNA bindet an Silica-Säulenmatrix unter Hochsalzbedingungen, unter Niedrigsalzbedinungen hingegen gibt die Matrix die DNA wieder frei. Daher sind Bindepuffer mit Salzen und Elutionspuffer ohne Salze formuliert.

Größere Fragmente binden stärker an die Säulenmatrix und sind schwieriger zu eluieren. Das Erwärmen des Elutionspuffers und/oder eine kurze Inkubation der Säulchen mit dem Elutionspuffer kann die Effizienz der Rückgewinnung deutlich verbessern.

Bei Plasmid Minipreps bringt der Einsatz von mehr Zellmaterial nicht notwendigerweise auch eine höhere Plasmid-DNA-Ausbeute. Zu große Mengen an Bakterien-Zellkultur können die Säule verstopfen. Dies reduziert die Effizienz der DNA-Bindung und verschlechtert die Ausbeute.

Setzen Sie daher für jede Säule eine optimale OD-Menge an Zellkultur ein. Details hierzu finden Sie in unseren Protokollen, dem Tutorial Dos and Don’ts der DNA-Aufreinigung und in den Guidelines for purifying low copy plasmids.

Nutzen Sie bei einer “low copy” Plasmidpräparation am besten Exonuclease V (RecBCD) um eventuelle Kontaminationen durch genomische DNA (gDNA) zu entfernen. Das Enzym verdaut selektiv die lineare gDNA und wirkt somit nicht auf zirkuläre Plasmid DNA.

Lesen Sie weitere Details in unserer Application Note “Using Exonuclease V (RecBCD) to eliminate residual genomic DNA when purifying low copy plasmids with the Monarch Plasmid Miniprep Kit”.

Bei der DNA-Aufreinigung mit Säulensystemen, bei denen ein Kunststoffring die Membran in der Säule fixiert, gelangen häufiger Ethanolreste ins Eluat. Dies inhibiert enzymatische Arbeitsschritte, und die DNA kann bei der Beladung von Agarosegelen aufschwimmen.

Daher wurden unsere Monarch DNA Cleanup Säulen sowie Monarch Plasmid Miniprep Säulen ohne den erwähnten Kunststoffring entwickelt, sodass das Risiko von Pufferübertragskontaminationen deutlich elimiert wurde.

Der häufigste Fehler bei der Gelextraktion ist das unvollständige Herauslösen der DNA aus dem Agarosegel. Daher ist es wichtig, die empfohlene Menge des Dissolving Buffers zu verwenden, um die Agarose vollständig aufzulösen. Erst dann sollte die weitere Aufreinigung durchgeführt werden.

Lesen Sie dazu auch unsere Sechs Tipps für eine perfekte Gelextraktion.