RNA Biologie Header

In vitro RNA Synthese

Hintergrund

Die in vitro RNA-Synthese ist eine wichtige Grundlage der rasant expandierenden RNA Forschung. Die Technik ist vielseitig und erlaubt Ihnen die maßgeschneiderte Synthese des optimalen Transkripts für Ihre Anwendung. Beginnend mit der Herstellung hochqualitativer Templates über die in vitro Transkription bis zur post-transkriptionellen Modifikation:

New England Biolabs versorgt Sie mit einem
vollständigen Set aller notwendigen Reagenzien für die RNA Synthese.

Unsere kostenlose Broschüre
RNA Synthesis –
From Template to Transcript

Hier anfordern
RNA Synthesis Brochure

Feature Article
Minding your caps and tails – considerations for functional mRNA synthesis

Download PDF

Technische Details

Im ersten Schritt der in vitro Synthese stellen Sie ein DNA Template mit der gewünschten Sequenz her. Dabei kann es sich um ein PCR Produkt oder ein Plasmid handeln, das durch Restriktionsverdau linearisiert wurde. Das Template wird dann von einer RNA Polymerase in Anwesenheit von Ribonucleosid-Triphosphaten (rNTP) transkribiert. Das Transkript kann nach der Synthese durch labeling, capping oder 3′ Polyadenylierung weiter prozessiert werden.

Template Herstellung

Die effektive in vitro Transkription beginnt mit einem hochqualitativen Template.
Wenn Sie Plasmid-DNA verwenden, muss diese für ein definiertes Ende des Transkripts vollständig linearisiert sein. Dafür eignen sich die bewährten Restriktionsenzyme von New England Biolabs.
Und wenn Sie von einem PCR-Produkt transkribieren möchten, ist die Q5 High-Fidelity DNA Polymerase die erste Wahl für eine garantiert fehlerfreie Template-Amplifikation.

Kombinierte RNA Synthese und Modifikation

Die beliebten High Yield RNA Synthese Kits von NEB sind optimal für hohe Erträge von bis zu 180 µg/rxn. Sie benötigen lediglich ein T7 (bzw. SP6) Promotor-basierendes dsDNA Template. Den Rest übernehmen unsere Kits. Das HiScribe T7 Quick High Yield RNA Synthesis Kit bietet Ihnen dabei einen effizienten Reaktionsansatz mit nur drei Pipettierschritten (NTP-Puffer Mix, T7 RNA Polymerase und Template-DNA).

Für mehr Flexibilität bieten wir Ihnen das HiScribe T7 High Yield RNA Synthesis Kit an:
Die separat formulierten Nukleotide erlauben dabei die freie Komposition eines benutzerdefinierten Nukleotid-Cocktails, z.B. den Austausch eines Nukleotids gegen ein modifiziertes Analogon.

Korrekte 5’ Caps und vollständige 3’ poly-(A)-Enden einer in vitro generierten mRNA sind essenziell für deren zuverlässige Translation, besonders bei anschließender RNA-Transfektion von Zellen in Zellkultur oder Injektion in einen Modellorganismus.

Das HiScribe T7 ARCA mRNA Synthese Kit bietet Ihnen die notwendigen Komponenten und Enzyme als praktische Mastermixe im Kit-Format für die schnelle und zuverlässige Synthese von „capped mRNA“ mittels Anti-Reverse Cap Analog (ARCA). Dieses Kit gibt es in zwei Versionen: mit und ohne poly-(A)-tailing/Polymerase-Option. In beiden Kits sind DNase I und LiCl für eine schnelle DNA-Template-Entfernung und mRNA-Aufreinigung bereits enthalten!

Praktische Mastermixe im HiScribe T7 Quick High Yield RNA Synthesis Kit (oben). Mehr Flexibilität und Austausch-Möglichkeit von dNTPs im HiScribe T7 High Yield RNA Synthesis Kit (unten).

Schnelle und zuverlässige Protokolle ergeben in gut 2 Stunden hohe mRNA-Erträge mit korrekten Caps und Tails

Erhöhte RNA-Ausbeute und Integrität durch zeitlich verlängerte Transkriptions-Reaktionen.

RNA Modifikation

Biologisch aktive mRNA enthält post-transkriptionelle Modifikationen, wie die 5’Cap Struktur oder die 3’Polyadenylierung. Diese dienen zur Stabilisierung und als Bindestelle für Translationsfaktoren.

Die effizienteste Methode um RNA zu cappen ist das enzymatische Vaccinia Capping System. Das 2 Protein-System mit insgesamt drei katalytischen Aktivitäten synthetisiert in unter einer Stunde natürliche Cap0-Strukturen (m7G5’ppp5’N) an nahezu 100% aller in vitro Transkripte. Das Vaccinia-Capping ist kompatibel mit der Cap0- zur Cap1-Umwandlung durch die mRNA Cap 2’-O-Methyltransferase. Die Umwandlung zu Cap1 führt zu einer signifikanten Erhöhung der Translationsausbeute.

Alternativ ist auch das co-transkriptionelle Capping durch den Einsatz von Cap-Struktur Analoga in die in vitro Transkription möglich. NEB bietet die Anti Reverse Cap-Analoga (ARCA) und weitere Cap Analoga für diese Anwendung an. Der Vorteil gegenüber Vaccinia Capping ist, das man Transkripte mit chemisch modifizierten Cap Strukturen herstellen kann. Der Nachteil dieser Methode liegt in geringeren Ausbeuten, sowie einem unvollständigen Capping des in vitro Transkripts (max. 80%).

Hilfe bei der Auswahl des für Sie geeigneten Cap Analogs bietet Ihnen unser RNA Cap Analog Selection Chart.

RNA Aufreinigung

Nach erfolgreicher in vitro Transkription wird das Template durch DNaseI Verdau abgebaut und das Produkt von DNA-Rückständen befreit. Wenn Sie mRNA synthetisieren, können Sie zusätzlich Oligo(dT)Beads zur Affinitäts-Reinigung Ihres Produktes verwenden.

Weiterführende Informationen finden Sie unter Technische Ressourcen oder auf neb.com. Informationen zu Namensrechten finden Sie hier.