DNA Modifizierung
Im Rahmen einer Klonierung ist es häufig erforderlich, die Enden eines DNA Moleküls zu modifizieren.
DNA Ligasen benötigen beispielsweise ein 5′ Mono-Phosphat am einen, und eine 3′ Hydroxyl-Gruppe am anderen zu ligierenden DNA Ende.
Auch kann es notwendig sein, die DNA Enden durch Blunting kompatibel zu machen, falls keine komplementären, kohesiven Enden vorliegen.
Die Dephosphorylierung eines mittels Restriktionsverdau geöffneten Vektors zur Verhinderung eines Re-Zirkulisation ist ebenfalls eine häufig durchgeführte Modifikation.
DNA Dephosphorylierung
Wenn ein Vektor durch den Verdau mit einem einzelnen Restriktionsenzym, oder 2 Enzymen die zu kompatiblen Enden führen, linearisiert wird, kann es bei der Ligationsreaktion zu einer Re-Zirkulisation des Vektors kommen.
Dies ist in der Regel unerwünscht, da dies zu einem erhöhten Leervektor-Hintergrund bei der Transformation führt.
Eine Vektor Dephosphorylierung mit einer Phosphatase kann die Re-Zirkulisation verhindern.
Video: DNA Dephosphorylierung
Unsere empfohlene Phosphatase für diese Anwendung ist die Quick CIP #M0525.
Die Quick CIP ist eine rekombinante und hitze-inaktivierbare Version der CIP (Calf intestinal phosphatase):
- Schnelle und dauerhafte Hitze-Inaktivierung
- Stabiler als das native Enzym, höhere Reinheit und Chargenkonsistenz durch rekombinanten Ursprung
- Schnelles und einfaches Reaktionssetup
- Flexible Reaktionsbedingungen (aktiv in allen Restriktionsenzym-Puffern ohne Aufreinigung)
- Hohe spezifische Aktivität
- Eine Phosphatase für eine Vielzahl von Anwendungen
Ebenfalls erhältlich sind die Antarctic Phosphatase #M0289 und die Shrimp Alkaline Phosphatase (rSAP) #M0371.
Blunting
Unter Blunting versteht man die Umwandlung eines einzelsträngigen Überhangs an einem DNA-Molekül, wie er durch einen Restriktionsverdau mit einem entsprechenden Enzym entstehen kann, in ein “stumpfes” (blunt) Ende, welches weder einen 3′- noch einen 5′-Überhang trägt.
Dies geschieht entweder durch Auffüllen, d.h. Einbau von Nukleotiden und Verlängerung des komplementären Stranges durch eine Polymerase-Aktivität, oder durch Abbau des Überhanges durch eine Exonuklease-Aktivität.
Video: DNA Blunting Tutorial
Blunting wird häufig durchgeführt um ursprünglich nicht-kompatible DNA-Enden, wie sie durch den Verdau mit unterschiedlichen Restriktionsenzymen entstehen können, auf die Ligation vorzubereiten.
Um 5′-Überhänge durch Auffüllen des Gegenstranges zu blunten und 3′-Überhänge ab zu bauen werden in der Regel T4 DNA Polymerase #M0203 oder Klenow Fragment (3’→5′ exo-) #M0210 verwendet.
Ist es notwendig, auch 5′-Überhänge abzubauen, so kann die Mung Bean Nuclease #M0250 eingesetzt werden.
Phosphorylierung
Für bestimmte Anwendungen oder Klonierungs-Szenarien kann es notwendig sein, ein DNA-Fragment zu phosphorylieren, damit eine Ligation durchgeführt werden kann.
PCR Produkte besitzen kein 5’Mono-Phosphat, wenn keine phosphorylierten Primer für die Reaktion verwendet wurden. Damit diese dennoch mit einem dephosphorylierten Vektor ligiert werden können, können die Produkte mit Hilfe der T4 Polynucleotide Kinase #M0201 phosphoryliert werden.
Video: DNA Phosphorylierung
Weiterführende Informationen finden Sie unter Technische Ressourcen oder auf neb.com. Informationen zu Namensrechten finden Sie hier.
