Golden Gate Assembly

Golden Gate Assembly (GGA) ist eine Methode zur effektiven, gerichteten Klonierung einzelner oder vieler DNA Fragmente ohne störende zusätzliche Basen an den Fragmentübergängen.

GGA nutzt die Eigenschaft von Typ IIS Restriktionsenzymen, außerhalb ihrer Erkennungssequenz zu schneiden. Beim Schneiden entstehen so definierte Basenüberhänge, die für die gerichtete Ligation Ihrer gewünschten DNA Fragmente in den Vektor genutzt werden. Die ursprüngliche Erkennungssequenz des Typ IIS Restriktionsenzyms ist im ligierten Vektor nicht mehr enthalten, sodass beim GGA Verdau und Ligation zeitgleich in einem Tube erfolgen können!
Nutzen Sie unser praktisches NEBridge Golden Gate Tool online, um die Überhangsequenzen für Ihr Klonierungsvorhaben zu designen. Denn die nötigen Typ IIS Schnittstellen und die komplementären Basen im Ligationsüberhang Ihrer Vektoren und Inserts bringen Sie vorab durch High-Fidelity PCR ein.

Ihre Vorteile:
  • Effizient – schnelle, gerichtete & nahtlose Multiplex-DNA-Klonierung
  • Flexibel – > 50 Fragmente unterschiedlicher Größen (< 100 bp bis > 15 kb) & GC-Gehalt
  • Innovativ – optimierte, neue Enzymentwicklungen verfügbar für GGA
  • Einfach – Primerdesign über NEB Golden Gate Assembly Tool auf unserer Webseite

Golden Gate Assembly ermöglicht so die spezifische Assemblierung mehrerer Fragmente ohne unerwünschte, zusätzliche Basen an den Übergängen. Die Genauigkeit hängt dabei von der Länge der überlappenden Bereiche ab. Daher werden für die Methode solche Typ IIS Restriktionsenzyme bevorzugt, die 4 Basen Überhänge erzeugen, wie BsaI/BsaI-HFv2BbsI/BbsI-HFBsmBI-v2 und Esp3I und PaqCI.

Golden Gate Assembly Workflow

Dank des einfachen Workflows eignet sich Golden Gate Assembly sowohl für einfache als auch komplexe Assemblierungen:

GGA Workflow Large

Die Golden Gate Assembly Reaktion läuft als simultane Single-Tube Reaktion ab. Hierzu wird das TypIIS Restriktionsenzym (REase), das außerhalb seiner nicht-palindromischen Erkennungssequenz schneidet, und die T4 DNA Ligase mit den vorbereiteten Inserts und Vektoren zusammengebracht. Die Schnittstellen können vorab mittels PCR Primern integriert werden. Inserts und Vektoren werden so designed, dass die TypIIS Erkennungsstelle distal zur Schnittstelle liegt. Während der Reaktion entfernt die TypIIS REase so die Erkennungssequenz aus dem Assembly und jedes assemblierte Fragment trägt den 3- oder 4-Basen langen komplementären Überhang, der die weitere Assemblierungsreihenfolge steuert. Die Fragmente verbinden sich komplementär, die T4 DNA Ligase schließt die Lücken, und das finale Produkt akkumuliert über die Zeit. Ein Cycling zwischen optimaler Restriktions- und Ligationstemperatur verstärkt die Effektivität der Golden Gate Assemblierung. Golden Gate Assembly kann für die zeitgleiche, gerichtete Assemblierung von 2 bis zu > 50 Fragmenten genutzt werden.

Unser kostenfreies NEBridge Golden Gate Tool hilft Ihnen beim Design der notwendigen Überhänge und stellt sicher, dass die Erkennungssequenz des gewählten Restriktionsenzyms nicht in einer der Zielsequenzen vorkommt.

Golden Gate Assembly Tool

Über 50 Fragmente gleichzeitig gerichtet klonieren
– Mit NEBs Golden Gate Produkten

NEB ist seit Jahren führend auf dem Gebiet des GGA. Basierend auf vorherigen Forschungsarbeiten zur Optimierung von Type IIS Restriktionsenzymen und DNA Ligasen sowie zum Verständnis der Sequenz-Präferenzen während der Ligation, hat unsere Forschungsgruppe um Greg Lohman kürzlich erstmals ein vollständiges Genom (das des Bakteriophagen T7) aus über 50 synthetisch hergestellten DNA Fragmenten simultan zusammengesetzt!

Damit ist die Tür weit aufgestoßen für neue Einsätze dieser Hochdurchsatz-Technologie.

Hier geht's zum Original-Artikel

Das obige Paper basiert auf den zuvor publizierten Arbeiten der gleichen Gruppe, die in der folgenden umfassenden Technical Note prima zusammengefasst sind:

PDF: GGA von 20+ Fragmenten

NEB bietet mehr Type IIS Restriktionsenzyme an als andere Anbieter, von denen die meisten auch für Golden Gate Assembly verwendet werden. Informationen zu allen Type IIS Restriktionsenzymen finden Sie in dieser Tabelle. Nutzen Sie gerne die Sortierungsfunktion in den Spaltenüberschriften der Tabelle für einen praktischen Vergleich der Eigenschaften unserer Enzyme.

Unser neustes Mitglied der Typ II S-Restriktionsenzym-Familie – PaqCI

PaqCI, ein AarI Isoschizomer, ist unser neustes Mitglied in der Typ II S-Restriktionsenzym-Familie, das für Golden Gate Assembly verwendet werden kann. Der besondere Vorteil dieses Enzyms ist, dass PaqCI eine Erkennungssequenz von 7 bp hat. Dadurch ist es weniger wahrscheinlich, dass die Erkennungssequenz in der zu assemblierenden DNA-Sequenz bereits vorhanden ist. So wird die Vorbereitung der Schnittstellen an den zu assemblierenden Fragmenten – die sogenannte Domestizierung – zum Kinderspiel.

PaqCI_Blog_TypeIIS

Lesen Sie in unserem Originalartikel mehr über die Besonderheiten von PaqCI und den Einsatzmöglichkeiten im Golden Gate Assembly.

Weitere umfangreiche Informationen zum Golden Gate Assembly finden Sie auch auf unserer USA-Website unter:

Golden Gate Assembly Homepage

Produkte für Golden Gate Assembly

PRODUKT Art.Nr.: GRÖSSE PREIS
NEBridge Ligase Master Mix M1100 50 rxns 89 € NEB Shop_icon NEB Info_icon
NEBridge Golden Gate Assembly Kit (BsmBI v2) E1602S 20 rxns 158 € NEB Shop_icon NEB Info_icon
NEBridge Golden Gate Assembly Kit (BsaI-HFv2) E1601S 20 rxns 158 € NEB Shop_icon NEB Info_icon
E1601L 100 units 421 €
BsmBI v2 R0739S 200 units 76 € NEB Shop_icon NEB Info_icon
R0739L 1.000 units 311 €
BsaI-HFv2 R3733S 1.000 units 72 € NEB Shop_icon NEB Info_icon
R3733L 5.000 units 295€
BbsI-HF R3539S 300 units 72 € NEB Shop_icon NEB Info_icon
R3539L 1.500 units 292 €
Esp3I R0734S 300 units 79 € NEB Shop_icon NEB Info_icon
R0734L 1500 units 352 €
Verschiedene Type IIS Restriktionsenzyme NEB Info_icon
PaqCI R0745S 200 units 95 € NEB Shop_icon NEB Info_icon
R0745L 1.000 units 380 €
T4 DNA Ligase M0202S 20.000 units 68 € NEB Shop_icon NEB Info_icon
M0202L 100.000 units 272 €
T4 DNA Ligase, conc. M0202T 20.000 units 68 € NEB Shop_icon NEB Info_icon
M0202M 100.000 units 272 €
Salt-T4 DNA Ligase M0467S 20.000 units 68 € NEB Shop_icon NEB Info_icon
M0467L 100.000 units 272 €
Hi-T4 DNA Ligase M2622S 20.000 units 68 € NEB Shop_icon NEB Info_icon
M2622L 100.000 units 272 €

Stand: 10.05.2022

Weiterführende Informationen finden Sie unter Technische Ressourcen oder auf neb.com. Informationen zu Namensrechten finden Sie hier.