Genome Editing ist die gezielte Veränderung des Genoms lebender Zellen
Die gezielte und kostengünstige Veränderung des Erbguts lebender Zellen wurde erst durch die Entwicklung neuer molekularer DNA-Schneidetechniken möglich.
Die zur Zeit bekannteste und meist diskutierte Genome Engineering Technologie basiert auf der bakteriellen CRISPR-assoziierten Protein-9 (Cas9) Nuclease aus Streptococcus pyogenes.
Video: Genome Editing
CRISPR Cas9 Genome Editing
Die Cas9 Nuclease ist ein RNA-abhängiges Enzym, das gezielt Doppelstrangbrüche an definierten DNA-Sequenzen einfügt. Die Sequenzspezifität erhält die Cas9 dabei durch die Bindung von „zielsuchender“ single guide RNA (sgRNA). Die gewünschte Zielsequenz (ca. 20 Nukleotide) der sgRNA muss dabei von jedem Experimentator bestimmt und in das sgRNA-Molekül eingebracht werden. Nach einem Cas9-induzierten Doppelstrangbruch der Wirtszell-DNA fügt das fehlerhafte nichthomologe Endjoining (NHEJ) bei der Reparatur Insertionen und/oder Deletionen (Indels) ein, die den betroffenen Locus zerstören. In Anwesenheit einer homologen Donor-DNA jedoch kann der Doppelstrangbruch alternativ über homologe Rekombination (HDR) repariert werden, wodurch gezieltes Gene Editing möglich ist.
Gene Editing mit Cas9 Nuclease
Die Transfektion mit Cas9 RNP (Ribonucleoprotein) Komplexen ermöglicht hocheffizientes Gene Editing
Um das Cas9 Protein und die sgRNA bei Gene Editing Experimenten in die Zelle einzubringen sind verschiedene Vorgehensweisen möglich:
- Transfektion von sgRNA/Cas9 Plasmiden
- Transfektion von sgRNA und Cas9 mRNA
- Co-Transfektion von sgRNA und Cas9 Protein (RNPs)
Jede Variante ist jeweils mit oder ohne HDR Template-Plasmid möglich.
Aktuelle Publikationen zeigen, dass der Einsatz von sgRNA/Cas9 RNP Komplexen derzeit als die beste Methode mit geringsten „off-target“-Effekten und höchsten Effizienzen angesehen wird.
NEBs Wissenschaftler konnten zeigen, dass die neue EnGen Cas9 NLS in HEK293-Zellen die höchsten Gene Editing-Effizienzen erzielt.
In unserem Webinar Gene Editing 101 erfahren Sie mehr über die Vorzüge der direkten Lipofektion von Cas9 sgRNA RNPs.
Webinar: Gene Editing 101
Wie immer Sie sich entscheiden:
NEB bietet Ihnen eine Reihe hilfreicher und zuverlässiger Reagenzien und Kits, die Ihre CRISPR Cas Genome Editing Experimente unterstützen.
Cas9 in vivo: Bakterielle Adaptive Immunität
CRISPR Systeme entwickelten sich als ein Weg adaptiver Immunität in Bakterien. Das Verständnis dieser Systeme in vivo ist Voraussetzung für deren Nutzbarmachung in vitro.
Downloads
Gene Editing Online Ressourcen
Plasmid Repositories:
http://www.addgene.org
CRISPR-gRNA Design Tools:
http://crispr.mit.edu
http://zifit.partners.org/ZiFiT/
http://www.e-crisp.org/E-CRISP/designcrispr.html
https://chopchop.rc.fas.harvard.edu/
Online Forums:
https://groups.google.com/forum/crispr
Organism-specific Resources:
http://wormcas9hr.weebly.com
http://www.flyrnai.org
Ausgewählte Produkte für den CRISPR/Cas9 Workflow
| CRISPR/Cas9 Anwendung | PRODUKT | Art.Nr.: | GRÖSSE | INFO | |
|---|---|---|---|---|---|
| Zentrale Komponente des CRISPR/Cas9-Workflows | EnGen® Spy Cas9 NLS | M0646T | 400 pmol |  |
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| M0646M | 2000 pmol | ||||
| EnGen® Spy Cas9 HF1 | M0667T | 500 pmol | |
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| M0667M | 2500 pmol | ||||
| Zentrale Komponente des CRISPR/Cas9-Workflows, ohne NLS | Cas9 Nuclease, S. pyogenes |
M0386S | 70 pmol | |
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| M0386T | 400 pmol | ||||
| M0386M | 2000 pmol | ||||
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EnGen® Lba Cas12a (Cpf1) | M0653S | 70 pmol | |
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| M0653T | 2000 pmol | ||||
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EnGen® Sau Cas9 | M0654S | 70 pmol | |
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| M0654T | 400 pmol | ||||
| Einfügen versetzter Doppelstrangbrüche an genomischen Loci durch zweifachen Einzelstrangbruch (Nick) | EnGen® Spy Cas9 Nickase | M0650S | 70 pmol | |
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| M0650T | 400 pmol | ||||
|
EnGen®Spy dCas9 (SNAP-tag®) | M0652S | 70 pmol | |
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| M0652T | 400 pmol | ||||
| Synthesis of sgRNA | EnGen® sgRNA Synthesis Kit,S. pyogenes | E3322S | 20 rxns | |
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| E3322V | 10 rxns | |
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| Überprüfung der Genome Editing-Effizienz | EnGen® Mutation Detection Kit | E3321S | 25 rxns | |
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Weitere ausgewählte NEB Produkte für den Einsatz in CRISPR Workflows: |
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| Synthese von sgRNA | HiScribe T7 High Yield RNA Synthesis Kit |
E2040S | 50 rxns | |
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| HiScribe T7 Quick High Yield RNA Synthesis Kit | E2050S | 50 rxns | |
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|
| Synthese von capped Cas9 mRNA | HiScribe T7 ARCA mRNA Kit (mit Tailing) | E2060S | 20 rxns | |
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| HiScribe T7 ARCA mRNA Kit | E2065S | 20 rxns | |
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| Insertion der Zielsequenz in den sgRNA Vektor | Q5 Site-directed Mutagenesis Kit (mit oder ohne comp. E. coli) |
E0554S | 10 rxns (+ komp. E.coli) |
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| E0552S | 10 rxns | |
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| Ultragenaue Amplifikation Ihrer Konstrukte im CRISPR Workflow | Q5 High-Fidelity DNA Polymerase |
M0491S | 100 u | |
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| M0491L | 500 u | ||||
| Q5 Hot Start High-Fidelity DNA Polymerase | M0493S | 100 u | |
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| M0493L | 500 u | ||||
| Einfache, isothermale Generierung Ihres Cas9-sgRNA Konstrukts und HDR Templates | NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix | E2621S | 10 rxns | |
|
| E2621L | 50 rxns | ||||
| E2621X | 250 rxns | ||||
| NEBuilder HiFi DNA Assembly Cloning Kit (inkl. comp. E. coli) |
E5520S | 10 rxns | |
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Stand: 01.01.2024
Weiterführende Informationen finden Sie unter Technische Ressourcen oder auf neb.com. Informationen zu Namensrechten finden Sie hier.
