EnGen sgRNA Synthesis Kit – Einfache Herstellung von Cas9 sgRNA in nur einer Reaktion
Mit dem EnGen sgRNA Synthesis Kit generieren Sie in weniger als einer Stunde sgRNA im Mikrogramm-Maßstab!
Sie benötigen lediglich ein 55 nt ssDNA Oligo als Template für die single guide RNA. Mit Hilfe des EnGen sgRNA Template Oligo Designer (ein Teilbereich des NEBioCalculator Webtools) kann dieses einfach konstruiert werden. Anschließend können Sie das sgRNA Template bei Ihrem bevorzugten Oligo-Lieferanten bestellen.
Den Rest übernimmt das EnGen sgRNA Synthesis Kit:
- Sie geben einfach den praktischen Enzyme- und Reaction-Mix zu Ihrem Oligo
- Die Reaktion wird für 30 min bei 37°C inkubiert
- Nach Aufreinigung ist die Cas9 sgRNA bereit zur Transfektion oder in vitro Applikationen.
Ein-Schritt-Reaktion des EnGen sgRNA Synthesis Kits:
A: Das Target-spezifische Oligo codiert die T7 Promotorsequenz, ~20 nt Target-spezifische Sequenz und 14 nt komplementäre Sequenz zum S. pyogenes Cas9 Scaffold Oligo, dass im Reaktionsmix vorliegt. Das Target-spezifische Oligo wird mit dem 2x Reaktionsmix (NTPs, dNTPs, S. pyogenes Cas9 Scaffold Oligo) sowie dem EnGen sgRNA Enzyme Mix (DNA und RNA Polymerasen) bei Raumtemperatur gemischt.
B: Bei 37°C lagern sich die Oligos an der 14 bp langen komplementären Sequenz zusammen.
C: Die DNA Polymerase füllt die einzelsträngigen Bereiche auf, es entsteht ein doppelsträngiges DNA Template.
D: Die RNA Polymerase erkennt die doppelsträngige Promotor-Region und initiiert die Transkription. Die resultierende single guide RNA wurde so in einem einzigen Reaktionsschritt in 30 Minuten hergestellt.
Synthese von sgRNA für andere CRISPR Nucleasen
Wenn Sie nicht mit Cas9 aus S. pyogenes arbeiten, sondern zum Beispiel EnGen Lba Cas12a, empfehlen wir folgenden Ansatz: Zunächst stellen Sie sich das DNA Template aus T7 Promotor, sowie Target und konstanter Sequenz der guide RNA zusammen. Hierfür können Sie beispielsweise die Expressionskassette eines single guide RNA Plasmids als Vorlage verwenden und die Target-Sequenz anpassen. Alternativ können Sie das Template auch aus synthetischen Oligos assemblieren. Zur in vitro Transkription empfehlen wir dann unsere leistungsstarken HiScribe RNA Synthese Kits.
Schema einer mehrstufigen Guide RNA Synthese. Durch PCR werden Template Oligos zu einem doppelsträngigen Transkriptionstemplate vervollständigt. In der anschließenden in vitro Transkription wird die Guide RNA synthetisiert.
Produkttabelle
| PRODUKT | Art. # | GRÖSSE | INFO | |
|---|---|---|---|---|
| EnGen® sgRNA Synthesis Kit S. pyogenes | E3322S | 20 rxns |  |
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| E3322V | 10 rxns | |
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| HiScribe™ T7 High Yield RNA Synthesis Kit | E2040S | 50 rxns | |
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| HiScribe™ T7 Quick High Yield RNA Synthesis Kit | E2050S | 50 rxns | |
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| Q5® High-Fidelity DNA Polymerase | M0491S | 100 units | |
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| M0491L | 500 units | |
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| Q5® Hot Start High-Fidelity DNA Polymerase | M0493S | 100 units | |
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| M0493L | 500 units | |
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Stand: 01.01.2024
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