EnGen Spy Cas9 HF1
Bei der neuen EnGen Spy Cas9 HF1 wurde die Fidelity durch vier Mutationen in der DNA-Binde-Domäne verbessert, sodass ungewollte Mutationen im Genom („off-target Effekte“) erheblich verringert werden. Lesen Sie hierzu mehr in der Nature-Publikation. Genauso wie der (weiterhin erhältliche) Vorgänger besitzt diese Cas9 Variante zwei NLS (C- und N-terminal) wodurch das Protein besser in den Zellkern aufgenommen wird und somit zu hohen Editing Effizienzen führt.
EnGen Spy Cas9 NLS
NEBs EnGen Spy Cas9 NLS #M0646 ist ein optimiertes Cas9 Protein mit dualer NLS (Nuclear Localization Sequence) für höchste Editing Effizienzen. Es bindet die zum Experiment benötigte, spezifische sgRNA, die die gewünschte, zu editierende Zielsequenz kodiert. Dieser Komplex aus sgRNA und Protein kann bequem in die Zielzellen transfiziert oder injiziert werden.
Das Resultat: Exzellente Gene Editing Effizienzen!
Auch erhältlich als Wildtyp-Version ohne NLS: Cas9 Nuclease, S. pyogenes #M0386. Die Wildtyp-Version ist gut geeignet für den Verdau gereinigter genomischer DNA oder auch für die Mikroinjektion.
Gene Editing Effizienzen (gemessen in % Modifikation nach T7 Endonuclease I Assay) nach Transfektion von Cas9 als Plasmid-DNA, mRNA oder Protein (sgRNA-RNPs) inkl. sgRNA (plasmidcodiert bzw. synthetische RNA) in HEK293-Zellen. Plasmid DNA und mRNA codierten für Cas9 2xNLS (N- und C-terminal), vergleichbar mit NEBs EnGen Cas9 NLS.
NEBs Cas9 in der Mikroinjektion im Kundenexperiment: in vivo Gene Editing bei Zebrafisch
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„The experiments with NEB Cas9 are going well, seems very effective with a variety of sgRNAs. The high conc. Cas9 protein is extremely efficient in vivo!“ James A. Gagnon, Department of Molecular and Cellular Biology, Harvard University, USA |
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Mutationen im Tyrosinase Gen inhibieren die Melanozytenpigmentierung im Zebrafisch: 18 μM Cas9 Protein (vorbeladen mit 10 sgRNAs gegen Tyrosinase) wurden in 1-Zell Embryos injiziert. Die Abbildung oben zeigt verschiedene Stadien der Pigmetierung 3 Tage nach Fertilisation. Bei einem Injektionsvolumen von 2 nl zeigen >90% der Embryos eine vollständige Inhibierung der Pigmentierung.
Mit freundlicher Genehmigung von James A. Gagnon, Department of Molecular and Cellular Biology, Harvard University, USA
Weitere Referenzen:Nakagawa, et al. Biology Open (2016) 0, 1-7, Ultra-superovulation for the CRISPR-Cas9-mediated production of gene-knockout, single-amino-acid-substituted, and floxed mice
EnGen Lba Cas12a (Cpf1)
- Alternative zur Cas9: DNA Endonuklease aus Lachnospiraceae bacterium ND2006, die mit einer einzelnen gRNA (single guide RNA) spezifisch versetzte Doppelstrangbrüche einführt.
- T-reiche PAM Sequenz (TTTN) eröffnet neue Regionen für Gene Editing, komplementär zur G-reichen PAM der Cas9.
- kurze gRNA: 40-44 nt
- zwei NLS für verbesserten Transport in den Nukleus
- Über weiten Temperaturbereich aktiv: 16-48°C
Anwendung:
- Editing in AT-reichen Regionen
- Durch Aktivität bei niedriger Temperatur optimal für ektotherme Organismen wie Zebrafisch oder Xenopus.
Abb. rechts: Breites Temperaturoptimum der Lba Cas12a.
Lba und Asp Cas12a Proteine wurden mit guide RNA als RNP Komplexe eingesetzt. Als Ziel DNA diente ein PCR Produkt, das am 5´-Ende mit FAM markiert wurde. Lba bzw. Asp Cas12a RNPs wurden mit der Ziel-DNA bei entsprechenden Temperaturen bei einem Einsatzverhältnis von 10:1 RNP zu DNA für 10 min. inkubiert. Die Analyse des DNA Verdaus erfolgte mittels Capillary Electrophoresis sowie Quantifizierung der Signalstärken (verdaut vs. nicht-verdaut).
Schematische Darstellung der Lba Cas12a Nuklease-Erkennungssequenz und DNA-Schneidedomäne.
EnGen Spy Cas9 Nickase
- Variante der EnGen Cas9 NLS, führt nur Einzelstrangbrüche ein
- Loss of function Mutation D10A inaktiviert RuvC Nuklease Domäne
Anwendung:
- Ermöglicht versetzten DNA Doppelstrangbruch
- Vielfache Spezifität durch zwei gRNAs pro Experiment (Target A und B)
- Optimal für Editing mit Homologie-Reparatur, da NHEJ nicht aktiviert wird.
Abb. rechts: Schematische Darstellung eines versetzten Doppelstrangbruchs mit EnGen Spy Cas9 Nickase #M0650. Durch Co-Transfektion einer Donor-DNA kann die gewünschte Mutation mittels Homologie-Reparatur (HDR) eingebracht werden.
EnGen Spy dCas9 (SNAP-tag)
- Variante der EnGen Cas9 NLS ohne Nuklease-Aktivität
- Programmierbare DNA Bindung
- SNAP-tag erlaubt kovalente Bindung von Fluorophoren, Biotin, u.v.m
Anwendung:
- Visualisierung spezifischer Gen-Loci in der Lebendzell-Färbung (live cell imaging)
- Anreicherung spezifischer Gen-Loci (Pull-down)
Abb. rechts: Schematische Darstellung der Proteinfusion aus EnGen Spy dCas9 mit SNAP-tag. Nach Bindung der dCas9-SNAP-Proteinfusion an einen Genlocus kann das Fusionsprotein kovalent mit einem SNAP-tag Fluorophor (imaging) oder SNAP-tag Bead (Pull-down) etc. markiert werden.
EnGen Sau Cas9
- Cas9 Enzym aus Staphylococcus aureus
- Programmierbare DNA Bindung
- Höhere Spezifität durch längere PAM Sequenz 5′-NNGRRT-3′
Abb. rechts: Schematische Darstellung der Sau Cas9 Nuklease Erkennungssequenz und DNA-Schneidedomäne.
Produkttabelle
| PRODUKT | Art. # | GRÖSSE | INFO | |
|---|---|---|---|---|
| EnGen® Spy Cas9 HF1 | M0667T | 500 pmol |  |
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| M0667M | 2500 pmol | |
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| EnGen® Spy Cas9 NLS | M0646T | 400 pmol | |
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| M0646M | 2000 pmol | |
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| Cas9 Nuclease, S. pyogenes | M0386S | 70 pmol | |
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| Cas9 Nuclease, S. pyogenes, conc. | M0386T | 400 pmol | |
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| M0386M | 2000 pmol | |
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| EnGen® Lba Cas12a (Cpf1) | M0653S | 70 pmol | |
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| M0653T | 2000 pmol | |
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| EnGen Sau Cas9 | M0654S | 70 pmol | |
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| M0654T | 400 pmol | |
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| EnGen® Spy Cas9 Nickase | M0650S | 70 pmol | |
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| M0650T | 400 pmol | |
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| EnGen® Spy dCas9 (SNAP-tag®) | M0652S | 70 pmol | |
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| M0652T | 400 pmol | |
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Stand: 01.01.2024
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