Die Phusion® High Fidelity DNA Polymerase ist eine künstlich hergestellte „Chimäre“ aus einer Pyrococcus-ähnlichen Polymerase und einer zusätzlich eingefügten dsDNA-bindenen Proteindomäne. Dank dieser ssO7d-Domäne ist die Prozessivität der Phusion Polymerase – d.h. die „Verweildauer“ pro Bindeereignis – im Vergleich zu anderen Enzymen dramatisch erhöht: es “saust” am Template DNA Strang entlang und die neue DNA wird in einem Bruchteil der Zeit synthetisiert. Die Phusion Polymerase ist daher besonders schnell und für längere Amplikons und für hohe Genauigkeit gut geeignet!
- Hohe Genauigkeit: 52-mal genauer als Taq
- Hohe Geschwindigkeit: nur 15-30 Sekunden/kb
- Lange Amplifikate mit hohen Ausbeuten auch bei schwierigen Templates
- Phusion® Hot Start Flex Variante: Aptamer-Technologie für erhöhte Flexibilität, Spezifität und Ausbeuten ganz ohne Hitze-Inaktivierung
Abb.: Phusion DNA Polymerase
Die eingefügte Doppelstrang-bindende “Enhancer”-Domäne (orange) ermöglicht eine extreme Prozessivität, Genauigkeit und Zuverlässigkeit. Auch als Phusion® Hot Start Flex Variante erhältlich: eine Aptamer-Technologie ermöglicht erhöhte Flexibilität, Spezifität und Ausbeuten ganz ohne Hitze-Aktivierung.
Abb.: Ein 3.8 kb Fragment wurde aus 50 ng genomischer Jurkat-DNA mit verschiedenen Polymerasen nach Angaben der Hersteller amplifiziert. Die Länge des Extensionsschritts wird in Minuten angegeben. Ladder L ist die 1 kb DNA Leiter #N3232.
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Fokus Genauigkeit
Für alle Anwendungen, in denen eine korrekte DNA Sequenz notwendig ist (z.B. DNA-Klonierung, Proteinexpression, Reportergenassays) benötigen Sie zur DNA Amplifikation mittels PCR eine Polymerase mit 3’->5’ Exonukleaseaktivität (genannt „proof-reading“). Diese Exonuklease „kontrolliert“ während der DNA Synthese jeden Einbau eines neuen dNTPs und „schneidet“ am 3’ Ende eine falsch eingebaute Base sofort wieder heraus. So wird eine nahezu fehlerfreie Synthese ermöglicht. Bekannte Polymerasen mit proof-reading Aktivität sind zum Beispiel NEBs Vent® und DeepVent® Polymerase, Pyrocossus furiosus (Pfu) Polymerase und andere archaebakterielle DNA Polymerasen sowie Phusion® DNA Polymerase. Die Genauigkeit des proof-readings, d.h. die Aktivität der 3’->5’ Exonuklease, ist von Polymerase zu Polymerase unterschiedlich und kann in sog. LacI Assays quantitativ gemessen und verglichen werden.
Abb.: Die Fehlerrate der NEB Phusion® Polymerase ist dank der zusätzlich eingefügten DNA-bindenen Domäne mit 4,4×10-7 sehr gering. Phusion DNA Polymerase ist über 50x genauer als Taq und über 6x genauer als Pfu DNA Polymerase. Eine noch höhere Genauigkeit finden Sie bei der Q5 DNA Polymerase.
Fokus Geschwindigkeit
Thermostabile (PCR-fähige) Polymerasen sind meist von Haus aus nicht besonders prozessiv. Das bedeutet, dass bei Bindung der Polymerase an der Template-DNA der zu synthetisierende DNA Strang nur um wenige Basen verlängert wird, bevor die Polymasere dissoziiert und erneut binden muss. Somit sind selbst für eine Verlängerung von nur kurzen DNA Sequenzen vielfache Bindungsereignisse notwendig. Der Prozess des kontinuierlichen „Dran-und-Weg“ ist daher der geschwindigkeitsbestimmende und limitierende Schritt der gesamten Reaktion.
Aufgrund des „dissoziativen“ Charakters der Polymerasen ergeben sich auch die aus der Praxis bekannten Cycler / Extensionzeiten von ca. 1 min pro Kilobase bei Taq DNA Polymerase. Bei Pfu und anderen Enzymen mit proof-reading Aktivität sind sogar bis zu 2 min pro Kilobase für eine hinreichende Amplifikationsausbeute notwendig.
Phusion® DNA Polymerase hingegen benötigt lediglich 15-30 Sekunden pro Kilobase für exzellente Ausbeuten!
Fokus Schwierige Templates
DNA mit besonderen Sekundärstrukturen, GC-reichen oder Loop-Sequenzen ist häufig nur sehr schwer oder gar nicht amplifizierbar: die Polymerase kann tatsächlich in diesen „schwierigen“ Sequenzen nur sehr schwer oder gar nicht wieder binden. Eine Amplifikation dieses Abschnittes bleibt daher häufig aus. Die Phusion® Polymerase ist dank der verbesserten Prozessivität auch für schwierige und lange Amplikons bestens geeignet. Durch die Wahl des beiliegenden GC-Puffers werden Sekundärstrukturen der Template-DNA gut aufgelöst und für die PCR zugänglich gemacht. Lange Amplikons z.B. bis 20 kb auf humaner gDNA werden mit der Phusion® Polymerase sehr gut amplifizierbar.
Beispiel: Ein 3,8 kb Fragment wurde aus Jurkat gDNA mit unterschiedlichen Polymerasen nach Herstellerempfehlungen amplifiziert. Die Extensionzeiten finden Sie über der jeweiligen Spur (in Minuten). Nur Phusion® DNA Polymerase amplifizierte dieses Amplikon mit hohen Ausbeuten.
Erhältliche Q5 Polymerase Produkte
ProdukttabelleStand: 01.01.2024
Legal notice
Licenses/Patents/Disclaimers:
Phusion® DNA Polymerase was developed by Finnzymes Oy, now a part of Thermo Fisher Scientific. This product is manufactured by New England Biolabs, Inc. under agreement with, and under the performance specifications of Thermo Fisher Scientific. Phusion® is a registered trademark and property of Thermo Fisher Scientific.
Notice to purchaser: Limited license.
The purchase price of this product includes a limited, non-transferable license under U.S. and foreign patents owned by BIO-RAD Laboratories, Inc., to use this product. No other license under these patents is conveyed expressly or by implication to the purchaser by the purchase of this product.
The purchase price of this product includes a limited, non-transferable license under a patent owned by New England Biolabs, Inc., to use this product. No other license under this patent is conveyed expressly or by implication to the purchaser by the purchase of this product.
Nucleic acid-based aptamers for use with thermophilic DNA polymerases are licensed exclusively by New England Biolabs, Inc. from SomaLogic, Inc. (See Patent Nos. 5,475,096; 5,670,637; 5,696,249; 5,874,557; and 5,693,502). New England Biolabs, Inc. gives the Buyer/User a non-exclusive license to use the aptamer-based Phusion Hot Start Flex DNA Polymerase for RESEARCH PURPOSES ONLY. Commercial use of the aptamer-based Phusion Hot Start Flex DNA Polymerase requires a license from New England Biolabs, Inc. Please contact busdev@neb.com for more information.
| PRODUKT | Art. # | GRÖSSE | INFO | ||
|---|---|---|---|---|---|
| Phusion® High-Fidelity DNA Polymerase | M0530S | 100 units |  |
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| M0530L | 500 units | |
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| Phusion® High-Fidelity PCR Master Mix with HF Buffer | M0531S | 100 rxns (50 µl/vol) | |
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| M0531L | 500 rxns (50 µl/vol) | |
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| Phusion® High-Fidelity PCR Master Mix with GC Buffer | M0532S | 100 rxns (50 µl/vol) | |
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| M0532L | 500 rxns (50 µl/vol) | |
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| Phusion® High-Fidelity PCR Kit | E0553S | 50 rxns | |
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| E0553L | 200 rxns | |
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| Phusion Hot Start Flex Polymerasen | |||||
| Phusion® Hot Start Flex DNA Polymerase | M0535S | 100 units | |
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| M0535L | 500 units | |
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| Phusion® Hot Start Flex 2X Master Mix | M0536S | 100 rxns (50 µl/vol) | |
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| M0536L | 500 rxns (50 µl/vol) | |
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| Passend dazu: | |||||
| Deoxynucleotide Solutions, Mix | N0447S | 8 µmol of each | |
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| N0447L | 40 µmol of each | |
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Weiterführende Informationen finden Sie unter Technische Ressourcen oder auf neb.com. Informationen zu Namensrechten finden Sie hier.
