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qPCR (Real-Time PCR) und RT-qPCR

Real-Time PCR

Als Real-Time PCR oder quantitative PCR (qPCR) bezeichnet man Methoden, die dem Nachweis und der Quantifizierung von Nukleinsäuren (DNA oder RNA) dienen. Beide Begriffe können synonym verwendet werden.

Man kann zwei grundlegende qPCR Ansätze unterscheiden:
Zum einen gibt es Methoden, die auf dem Einbau von Fluoreszenz-Farbstoffen in doppelsträngige DNA beruhen. Hier spricht man von farbstoffbasierter qPCR (Dye-based).
Zum anderen existieren verschiedene Lösungen, bei denen Fluoreszenz-markierte DNA Sonden eingesetzt werden. Folglich spricht man hier von sondenbasierter qPCR (Probe-based).

Video: qPCR Grundlagen & Anwendungen

In unserem Video erklären wir die Grundlagen der Real-Time PCR, Anwendungsgebiete und Methoden zur Analyse von qPCR Ergebnissen.

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Farbstoffbasierte qPCR

Bei farbstoffbasierten Real-Time PCR Methoden wird in Echtzeit die Fluoreszenz eines Farbstoffs, welcher spezifisch an doppelsträngige DNA (dsDNA) bindet (z.B. SYBR® Green), gemessen. Der Farbstoff zeigt eine schwache Hintergrundfluoreszenz, die bei der Bindung an dsDNA dramatisch zunimmt. Die Amplifikation der Zielsequenz führt somit zu einer Erhöhung der Fluoreszenz, die direkt proportional zur Menge der bei jedem PCR-Zyklus vorhandenen dsDNA ist. Diese Art von Real-Time PCR erfordert nur zwei sequenz-spezifische Primer. Die farbstoffbasierte Real-Time PCR stellt somit einen schnellen und kostengünstigen Weg dar, um eine große Anzahl von Proben zu untersuchen.

Ein Nachteil dieser farbstoffbasierten Methoden ist, dass sie jede in der Reaktion vorhandene dsDNA nachweisen. Dazu gehören auch unspezifische Produkte oder Primer-Dimere, was zu einer ungenauen Quantifizierung führen kann. In der Regel wird daher nach jedem qPCR-Experiment eine Denaturierungs-/ Schmelz-Kurve erstellt, um die Reaktionsspezifität zu überprüfen. So kann man sicherstellen, dass nur das gewünschte Ziel amplifiziert wurde. Darüber hinaus kann im Gegensatz zur sondenbasierten Real-Time PCR, welche Multiplexing erlaubt, in einem farbstoffbasierten qPCR-Experiment jeweils nur eine Zielsequenz quantifiziert werden.

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Sondenbasierte qPCR

Bei der sondenbasierten Real-Time PCR wird, ebenfalls in Echtzeit, die Fluoreszenz einer fluorophormarkierten, sequenzspezifischen Sonde gemessen.
Da die sondenbasierte qPCR typischerweise spezifischer ist als die farbstoffbasierte ist sie oft die bevorzugte Technologie für diagnostische Anwendungen.

Die sondenbasierte Real-Time PCR ermöglicht die Quantifizierung mehrerer Targets in einer einzigen Reaktion (Multiplexing). Hierzu wird ein spezifischer Fluorophor für jedes Target verwendet.

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Die Sondendesigns können variieren, am gebräuchlichsten sind sog. Hydrolysesonden (z.B. TaqMan®). Diese beinhalten einen 5′-Reporter Fluorophor und einen 3′-Quencher auf einem kurzen Oligonukleotid, das komplementär zur Zielsequenz ist. Der Fluoreszenz-Resonanz-Energietransfer (FRET) zwischen Reporter und Quencher verhindert die Emission des Fluorophors, solange die Oligosonde intakt ist (geringe Fluoreszenz). Während jedes PCR-Zyklus hydrolysiert die 5′ Flap-Endonuklease Domäne der verwendeten Taq DNA Polymerase die Sonde, während der Primer verlängert und die Zielsequenz amplifiziert wird. Dadurch wird der Reporter Fluorophor vom Quencher räumlich getrennt, was zu einer amplifikationsabhängigen Erhöhung der Fluoreszenz führt.

Neben den Hydrolysesonden existieren noch weitere Sondendesigns, wie Molecular Beacons, Scorpions® und Dual-Hybridisierungssonden.
Molecular Beacons und Scorpions® basieren ebenfalls darauf, dass durch die räumliche Trennung eines Reporterfluorophors und eines Quenchers während der PCR Fluoreszenz frei wird.
Hybridisierungssonden (LightCycler®-Sonden) basieren ebenfalls auf FRET, allerdings wird hier durch den Energietransfer Fluoreszenz erzeugt. Zwei sequenzabhängige Sonden mit kompatiblen FRET-Farbstoffen binden dabei in räumlicher Nähe an die Zielsequenz. Die Anregung des Donor-Fluorophors, der sich am 3′-Ende der ersten Sonde befindet, bewirkt die Emission des Akzeptor-Fluorophors, welcher sich am 5′-Ende der zweiten Sonde befindet. Wird das Target amplifiziert, so nimmt das Fluoreszenzsignal des Akzeptor-Fluorophors zu.

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RT-qPCR

Die Real-Time PCR kann auch für die Detektion und Quantifizierung von RNA verwendet werden. Dazu wird ein Reverse-Transkriptase-Schritt vor dem eigentlichen Real-Time-PCR-Assay durchgeführt (RT-qPCR), die RNA wird in cDNA umgeschrieben.

Die reverse Transkription kann separat von der PCR oder direkt im qPCR-Mix durchgeführt werden. Passieren beide Schritte in der gleichen Reaktion, so spricht man von einer One-Step RT-qPCR.

One-Step-Workflows werden in der Regel in molekulardiagnostischen Assays bevorzugt, in denen nur ein bestimmtes Target nachgewiesen werden muss.

Unterschied One-Step & Two-Step RT-qPCR

RT-qPCR OneStep vs TwoStep

Eine separate cDNA-Synthese mit anschließender qPCR (Two-Step RT-qPCR) wird eingesetzt, wenn mehrere Targets aus dem gleichen Ausgangsmaterial nachgewiesen werden sollen, oder wenn eine Archivierung der cDNA erforderlich ist.

Unsere Luna qPCR Produkte:

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Luna® Universal qPCR Master Mix M3003S 200 rxns (2x1ml) 105 € In den Shop wechseln Produktinformationen
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Luna® Universal One-Step RT-qPCR Kit E3005S 200 rxns 218 € In den Shop wechseln Produktinformationen
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Luna® Universal Probe One-Step RT-qPCR Kit E3006S 200 rxns 198 € In den Shop wechseln Produktinformationen
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LunaScript RT SuperMix Kit E3010S 25 rxns 125 € In den Shop wechseln Produktinformationen
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Stand: 03.01.2019

TaqMan® is a registered trademark of Roche Molecular Systems, Inc.
SYBR® is a registered trademark of Molecular Probes, Inc.

Weiterführende Informationen finden Sie unter Technische Ressourcen oder auf neb.com. Informationen zu Namensrechten finden Sie hier.